ДС-ИФА-HBsAg — 0,01

 

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДС-ИФА-HBsAg-0,0

 

Тест-система иммуноферментная для выявления или подтверждения специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови человека и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне).

Технические данные:

Модель ДС-ИФА-HBsAg — 0,01
Суммарное время инкубаций 1ч 25 мин. (шейкер), 2ч 25 мин. (термостат).
Чувствительность 0,01 МЕ/мл.
Срок годности 24 мес.

Подходит для ручной постановки и постановки на автоматических анализаторах.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДС-ИФА-HBsAg-0,01                                                                                                                                                                          ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА 

 
Проведена оценка новой высокочувствительной тест-системы для выявления поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» (Приоритетная справка № 2006129019 от 10.08.2006). Оценку чувствительности теста проводили с использованием отраслевого стандартного образца ОСО-HBsAg 42-28-311-06П, образцов панелей «Boston Biomedica Inc.» (Вест Бриджуотер, Массачусетс, США) и «ZeptoMetrix Corp.» (Буффало, Нью-Йорк, США). Полученные данные показали, что «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» выявляет различные субтипы HBsAg с одинаковой эффективностью и на более раннем сроке сероконверсии относительно тестов сравнения. Наряду с высокой аналитической и диагностической чувствительностью система характеризуется высокой диагностической специфичностью.

Поверхностный антиген вируса гепатита В — НВsAg является основным маркером заболевания, регистрируемым задолго до появления клинических признаков болезни. Современные методы выявления HBsAg позволяют обнаруживать его в чрезвычайно низких концентрациях.

Согласно Приказу МЗ РФ № 322 от 2002 г. для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления HBsAg с 2003 г. регламентируется чувствительность не менее 0,1 МЕ/мл. Однако в отдельных случаях концентрация HBsAg в сыворотке или плазме крови может быть ниже предела чувствительности большинства используемых тест-систем, разрешенных к применению и имеющих диагностическую чувствительность 0,1 МЕ/мл:

— в инкубационном периоде, до начала клинических проявлений заболевания и перед исчезновением НВsAg из крови;

— в случае скрытой инфекции, так называемого оккультного гепатита, при котором не выявляются никакие маркеры вируса, но присутствует вирусная ДНК; другим вариантом скрытой инфекции может быть отсутствие детектируемых концентраций HBsAg при наличии антител к HBsAg [2,4];

— при формировании мутаций в вирусном геноме, вызывающих изменение структуры антигенных эпитопов НВsAg или биологических свойств вируса, например снижение секреции вируса из клеток [6]; при изменении антигенной структуры снижается «узнаваемость» НВsAg с помощью сертифицированных диагностических тестов, и следовательно требуется бóльшая его концентрация для детекции;

— при коинфекции вирусами гепатитов В и С или гепатита В и ВИЧ в результате подавления репликации вируса гепатита В другими вирусами [1, 3, 5].

Случаи возникновения посттрансфузионного гепатита В в результате использования «серонегативной» по HBsAg крови свидетельствуют о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение методов детекции антигена, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности.

Цель настоящей работы – оценка иммуноферментной тест-системы, предназначенной для выявления или подтверждения поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) с чувствительностью 0,01 МЕ/мл.

Таблица 1.
Оценка диагностической специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
на разных категориях населения

Группа обследуемых Количество исследуемых образцов Количество ложнополо-жительных результатов Специфичность

в данной группе, %

Здоровые доноры 5348 11 99,8
Больные с различными неинфекционными заболеваниями 95 1 98,9
Беременные женщины 381 3 99,2
Анти-HCV-позитивные 972 3 97,7
ВИЧ-инфицированные 494 4 99,2
Всего 7290 22 99,7

Материалы и методы.

Характеристика теста. В основе нового теста лежит принцип амплификации или усиления сигнала за счет использования пары — биотинового и стрептавидинового конъюгатов. Действующим началом разработанной тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» являются моноклональные антитела мыши к HBsAg (анти-HBs; «HyTest», Финляндия), сорбированные на стрипах полистиролового планшета («Nunc», Дания). Исследуемый образец вносили в лунку по 0,1 мл. Без стадии отмывки последовательно вносили конъюгат-1, представляющий моноклональные антитела мыши к HBsAg, ковалентно связанные с биотином (ООО НПО «Диагностические системы», Н.Новгород), затем — конъюгат-2 — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена («Sigma-Aldrich», Германия). Общая продолжительность реакции — 2 ч 25 мин (42°С).

При использовании шейкера (42°С) время проведения анализа сокращается до 1 ч 25 мин.

Стандартные образцы и панели. Аналитическую чувствительность нового теста оценивали с использованием Отраслевого стандартного образца ОСО-HBsAg 42-28-311-06П (ООО НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород, совместно с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора), содержащего HВsAg в концентрации 20 МЕ/мл, откалиброванного по 2-му Международному стандартному образцу HBsAg — Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, NIBSC code number 00/588. Диагностическую чувствительность разработанной тест-системы анализировали с использованием образцов различных панелей: «Референс-панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), субтипы ay и ad» (ЗАО «Медицинский центр «Авиценна»), «Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg» (ЗАО «Вектор-Бест»), «Мастер-панель сывороток крови человека, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) субтипов ay и ad» (ГНЦ ВБ «Вектор»), «Контрольная панель мутантных вариантов HBsAg субтипов ayw1 и adw2» (ООО НПО «Диагностические системы»), панели производства «Boston Biomedica Inc.» (BBI), West Bridgewater, Массачусетс, США: HBsAg low titer performance panel PHA106; Hepatitis B surface antigen sensitivity panel PHA807 и PHA808, сероконверсионные панели Hepatitis B seroconversion panel subtype ad – PHM928, PHM932, PHM933, PHM934, PHM935A(M), PHM935B, PHM911 и сероконверсионные панели производства «ZeptoMetrix Corp.» (ZMC; Буффало, Нью-Йорк, США) – «Hepatitis B seroconversion panel» (Catalog No. HBV 6277, 6278, 6279) и «Acute to recovered disease Hepatitis B seroconversion panel» (Catalog No. HBV 6281). Исследования проводили в 2005-2006 гг. в лаборатории ООО НПО «Диагностические системы», в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора РФ и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (CDC; Атланта, США).

Для оценки диагностической специфичности разработанной тест-системы исследовали 7290 образцов сыворотки (плазмы) крови. Из них — 5348 образцов сыворотки (плазмы) крови здоровых доноров, любезно предоставленных сотрудниками ГУЗ Нижегородская областная станция переливания крови им. Н.Я.Климовой, 494 образца сыворотки крови ВИЧ-инфицированных лиц, 972 образца сыворотки крови анти-HCV-позитивных лиц,

381 образец сыворотки крови беременных женщин и 95 образцов от больных с различными неинфекционными заболеваниями (патология сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, онкологические заболевания).

В работе использовали также образцы некоторых мутантных вариантов рекомбинантного HBsAg (n=9) (ООО «НПО «Диагностические системы»).

Результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составила 0,01МЕ/мл. Наряду с высокой чувствительностью, разработанная система характеризуется высокой специфичностью, которая в среднем составляет 99,7% с небольшими колебаниями в пределах исследуемых групп (табл.1).

Таблица.
Оценка диагностической специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
на разных категориях населения

Группа обследуемых Количество исследуемых образцов Количество ложнополо-жительных результатов Специфичность

в данной группе, %

Здоровые доноры 5348 11 99,8
Больные с различными неинфекционными заболеваниями 95 1 98,9
Беременные женщины 381 3 99,2
Анти-HCV-позитивные 972 3 97,7
ВИЧ-инфицированные 494 4 99,2
Всего 7290 22 99,7

Результаты тестирования образцов сывороток панели BBI «HBsAg low titer performance panel PHA106» с низким содержанием HBsAg (от 0,05 до 0,6 МЕ/мл) на разных тест-системах показали, что коэффициенты позитивности (отношение величины оптической плотности исследуемого образца к критической величине оптической плотности) образцов панели в «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» значительно превышали коэффициенты позитивности образцов в тестах сравнения. Система с повышенной чувствительностью эффективно выявляла HBsAg субтипов ad и ay во всех образцах панелей «Hepatitis B surface antigen sensitivity panel» BBI-807 и BBI-808 также с более высокими коэффициентами позитивности, чем в тесте сравнения.

Диагностическую чувствительность системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» анализировали на образцах 10 сероконверсионных панелей. Для сравнения использовали данные тестирования сероконверсионных образцов системами зарубежных производителей, представленные в инструкциях и паспортах к панелям. Подсчитывали общее количество реактивных образцов во всех панелях, выявленных каждым тестом. Систему, имеющую наибольшее количество позитивных по HBsAg образцов, признавали наиболее чувствительной. Кроме этого, определяли суммарное время (в сутках) с момента начального забора крови до 1-го позитивного образца с подсчетом средней величины.
Таблица 2

Результаты детекции HBsAg в сероконверсионных образцах 10 панелей.

Наименование панели Количество образцов, позитивныхпо HBV ДНК Количество HBsAg-позитивных образцов
ДС-ИФА-HBsAg-0,01 Abbott PRISM Abbott AxSYM
BBI PHM 928 (n=7) 7 (0) 6 (2) 5 (7) 5 (7)
BBI PHM 932 (n=16) 16 (0) 12 (36) 8 (50) 7 (61)
BBI PHM 933 (n=6) 6 (0) 6 (0) 5 (2) 4 (7)
BBI PHM 934 (n=6) 6 (0) 6 (0) 6 (0) 5 (3)
BBI PHM 935A (M) (n=20) 17 (9) 17 (9) 14 (21) 13 (23)
BBI PHM 935B (n=12) 6 11 10 9
ZMC HBV 6277 (n=11) 8 (26) 9 (21) 6 (33) 4 (40)
ZMC HBV 6278 (n=11) 11 (0) 10 (4) 8 (12) 8 (12)
ZMC HBV 6279 (n=7) 4 (19) 5 (14) 2 (26) 1 (28)
ZMC HBV 6281 (n=12) 10 (0) 11 (0) 6 (19) 5 (22)
Общее количество образцов 91 93 70 61
Среднее время с момента начального забора крови до выявления 1-го позитивного образца, сут 6,0 9,6 18,9 22,6

Примечание. В скобках – время (в сутках) с момента начального забора крови lо выявления 1-го позитивного образца; n – количество образцов в каждой панели.
Как следует из данных табл.2, тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» демонстрирует наилучшую чувствительность, выявляя 93 образца как HBsAg-позитивные из общего количества сероконверсионных образцов (n=108).

Один из альтернативных тестов детектировал HBsAg в 70 из 108 образцов, другой – лишь в 61. Вирусную ДНК детектировали в 91 образце. Время 1-ой детекции HBsAg с момента 1-го забора крови варьировалось от 0 до 50 дней (в среднем 18,9 дня) для 1-го теста сравнения и от 3 до 61 дня (в среднем 22,6 дня) – для 2-го теста. Для теста «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» момент 1-й детекции HBsAg приходился на 0-36-е сутки (в среднем 9,6 дня). Время 1-й детекции вирусной ДНК варьировалось от 0 до 26 дней и в среднем составило 6 дней. Таким образом, обобщенные результаты тестирования сероконверсионных панелей демонстрируют, что использование теста с повышенной чувствительностью позволяет сократить HBsAg-негативный период и приблизить момент выявления ДНК на 9,3 дня по сравнению с 1-м альтернативным тестом и на 13 дней – по сравнению со 2-м тестом (рис.1).

Рис.1. Возможность сокращения HBsAg-негативного периода при использовании теста «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» (результаты обобщенного анализа 10 сероконверсионных панелей).

Цифрами на рисунке обозначено время выявления (в сутках) 1-го позитивного образца с момента 1-го забора крови.

Детальный анализ соотношения во времени моментов 1-го выявления HBsAg тест-системой «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» и обнаружения вирусной ДНК по каждой сероконверсионной панели показал, что в образцах панелей BBI PHM933, PHM934, PHM935A(M) и ZMC HBV6281 время 1-ой детекции HBsAg и вирусной ДНК совпадает (1·10² — 4·10² копий/мл). При тестировании образцов панелей ZMC HBV6277 и HBV6279 в тесте с повышенной чувствительностью время определения HBsAg на 1 забор крови опережает момент 1-й детекции вирусной ДНК (1·10² копий/мл) (рис.2).

Рис.2 Соотношение времени начальной детекции HBsAg ДНК HBV в период сероконверсии в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» (результаты анализа 10 сероконверсионных панелей).

По оси ординат – время (в сутках) с момента начального забора крови до выявления 1-го позитивного образца; по оси абсцисс – панели: 1- BBI PHM 911(1·10² копий/мл); 2 — BBI PHM 928 (< 4·10² копий/мл);

3 — BBI PHM 932 (< 4·10² копий/мл); 4 — BBI PHM 933 (< 4·10² копий/мл); 5- BBI PHM 934 (4·10² копий/мл);

6 — BBI PHM 935А (M) (6·10² копий/ мл); 7 — ZMC HBV 6277 (1·10² копий/мл); 8 — ZMC HBV 6278 (1·10² коп./мл);

9 — ZMC HBV 6279(1·10² копий/ мл); 10 — ZMC HBV 6281(1·10² копий/мл). Сплошная линия — ДНК HBV, пунктирная – HВsAg.

Стрелками обозначен момент одновременной или более ранней по сравнению с ДНК HBV детекции HВsAg.
Из приведенных данных следует, что 10-кратное повышение чувствительности скринингового теста позволяет выявлять HBsAg в крови одновременно с вирусной ДНК или даже раньше.

По результатам тестирования образцов панелей BBI PHM935 и ZMC HBV6281, полученных от индивидуальных доноров в динамике в период сероконверсии, охватывающий моменты появления и исчезновения HBsAg, установлено, что система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» определяет HBsAg в более ранних образцах и в более поздних по мере исчезновения, по сравнению с тестами с более низким уровнем чувствительности. Следствием этого стало увеличение позитивного по HBsAg периода на 26-29 дней — для ZMC HBV6281 в зависимости от теста сравнения. Кроме этого обнаружено, что период выявления HBsAg системой «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» дольше периода деструкции вирусной ДНК в образцах панели BBI PHM935 на 73 дня и в образцах панели ZMC HBV6281 – на 7 дней (ри.3).

Рис.3. Сравнительная продолжительность позитивных по HBsAg и HBV ДНК периодов на различных тестах в образцах двух сероконверсионных панелей — BBI PHM935 (а) и ZMC HBV6281 (б), охватывающих моменты появления и исчезновения HBsAg.

По оси ординат – время (в сутках) с момента начального забора крови до выявления 1-го позитивного образца; по оси абсцисс – тест-системы: 1- ПЦР (1·10², 5·10² копий/мл); 2 — «ДС-ИФА-HBsAg-0,01»;

3 – Abbott Auszyme; 4 – Abbott PRISM; 5 – Abbott AxSYM; 6 – Organon Teknika Uni-form II; 7 – Ortho Test Systems 3. Нижний маркер – 1-й позитивный образец; верхний – последний позитивный образец. Отрезками показана продолжительность позитивного периода.
В июне 2006 г. тест-система была передана ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора для проведения медицинских испытаний. Материалами для изучения тест-системы служили 40 образцов сывороток крови от пациентов, страдающих острым и хроническим вирусным гепатитом В, и 120 образцов сывороток крови здоровых доноров. Кроме того, диагностическую чувствительность и специфичность тест-системы оценивали с помощью панелей сывороток: «Мастер-панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих HBsAg субтипов ad и ay» (ГНЦ ВБ «Вектор»), «Стандартная панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих HBsAg (ЗАО «Вектор-Бест»), «Референс-панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), субтипы ay и ad» (ЗАО «Медицинский центр «Авиценна»). При исследовании сывороток крови пациентов, страдающих гепатитом В, и положительных сывороток мастер-панели тест-система продемонстрировала 100% диагностическую чувствительность. Коэффициенты позитивности положительных образцов панелей и сывороток крови больных в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» значительно превышали коэффициенты позитивности данных образцов, протестированных в препаратах сравнения. При исследовании отрицательных проб сывороток крови пациентов инфекционной больницы тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» продемонстрировала 100% специфичность. При тестировании отрицательных проб сыворотки мастер-панели тест-система выявила HBsAg в 8 образцах, ранее считавшихся отрицательными, наличие HBsAg в которых было подтверждено с помощью конкурентного ИФА (подтверждающий тест). Препараты сравнения не обнаружили HBsAg в данных образцах, что подтверждает более высокую диагностическую чувствительность новой тест-системы. Таким образом, при испытании тест-системы в ГИСК им. Л.А.Тарасевича диагностические специфичность и чувствительность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составили 100%.

Способность теста с повышенной чувствительностью выявлять мутантные формы HBsAg относительно тест-систем с более низким уровнем чувствительности оценивали с помощью «Контрольной панели мутантных вариантов HBsAg субтипов ayw1 и adw2» (ООО НПО «Диагностические системы»). Образцы панели представляют собой 13 рекомбинантных мутантных вариантов HBsAg, экспрессированных в клетках Pichia pastoris. Рекомбинантные мутанты HBsAg содержат известные точечные мутации в детерминанте «а» субтипов ayw1 и adw2. Каждый мутантный вариант HBsAg в панели представлен в двух разведениях. Анализ данных показал, что тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» характеризуется более высокой реактивностью по отношению к мутантным формам вируса по сравнению с другими тест-системами.
Таблица 3.

Сравнительная реактивность мутантных вариантов рекомбинантного HBsAg

Мутантный вариант рекомбинантного HBsAg ДС-ИФА-HBsAg-0,01 Тесты сравнения
1 2 3
rec HBsAg ayw1 G145R 42,57,9 11,52,1 1,50,7 4,01,3
rec HBsAg adw2 G145R 17,04,4 6,11,7 1,10,6 3,71,5
rec HBsAg adw2 Q129R 5,25,4 3,51,8 0,70,6 0,80,8
rec HBsAg adw2 Q129H 34,18,6 10,22,4 1,10,6 2,61,2
rec HBsAg adw2 Q129L 6,55,4 3,31,7 0,90,7 0,90,8
rec HBsAg adw2 T143K 9,11,9 3,00,7 0,60,5 0,80,7
rec HBsAg adw2 T 126N 12,22,8 3,50,9 1,00,7 1,10,8
rec HBsAg adw2 T 126S 2,94,5 2,01,6 1,10,8 0,90,9
rec HBsAg adw2 D144A 8,24,0 2,41,1 0,60,5 0,90,8
rec HBsAg adw2 M133H 20,53,7 7,51,1 1,10,6 2,61,1
rec HBsAg adw2 M133L 40,59,0 132,0 1,40,7 3,71,3
rec HBsAg adw2 K141E 14,75,0 4,41,2 1,30,7 2,11,0
rec HBsAg adw2 P142S 29,56,3 5,31,5 1,40,8 2,21,2

Примечание. Данные представлены в виде коэффициента позитивности (отношение величины оптической плотности исследуемого образца к критической оптической плотности).
Как следует из данных табл.3, коэффициенты позитивности выявления мутантных вариантов HBsAg в разработанной системе превышают таковые в тестах сравнения.

Известно, что существует проблема выявления HBsAg при коинфицировании вирусом гепатита В и другими вирусами. Были проанализированы 473 образца сыворотки крови анти-ВИЧ-позитивных лиц. В 82 из ни обнаружен HBsAg. В 16 образцах сывороток крови от лиц с двойной инфекцией ВИЧ/вирусный гепатит В выявлен HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл. Причем 7 из них содержали антитела к HBcAg, а 9 не имели никаких других маркеров, кроме HBsAg, детектируемого в системе с высокой чувствительностью
Таким образом, полученные результаты демонстрируют высокую диагностическую значимость системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01». Использование высокочувствительного теста для выявления HBsAg позволяет сократить период диагностического (серологического) окна при вирусном гепатите В. Это положительно отразится на качестве диагностики гепатита, позволит снизить количество случаев скрытой инфекции, как с наличием дополнительного маркера анти-HBcore, так и при отсутствии любых маркеров, а также поможет скорригировать терапию при двойной инфекции. Высокая чувствительность тест-системы будет способствовать более эффективному выявлению мутантных форм HBsAg. Повышение чувствительности иммуноферментного теста для выявления HBsAg до уровня, сравнимого с чувствительностью молекулярно-генетических методов, позволяет рассматривать его в качестве возможной альтернативы другим методам, доступной и в рутинной лабораторной практике, которая повысит качество скрининга донорской крови и позволит снизить риск посттрансфузионного инфицирования вирусом гепатита В.

Обзоры

Отзывов пока нет.

Будьте первым, кто оставил отзыв на “ДС-ИФА-HBsAg — 0,01”