ДС-ИФА-HBsAg — 0,01
- для выявления или подтверждения специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови человека и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне)
Тест-система иммуноферментная для выявления или подтверждения специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови человека и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне).
Полное описаниеТест-система иммуноферментная для выявления или подтверждения специфичности результатов выявления поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови человека и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне).
Технические данные:
| Модель | ДС-ИФА-HBsAg — 0,01 |
| Суммарное время инкубаций | 1ч 25 мин. (шейкер), 2ч 25 мин. (термостат). |
| Чувствительность | 0,01 МЕ/мл. |
| Срок годности | 24 мес. |
Подходит для ручной постановки и постановки на автоматических анализаторах.
Чувствительность набора (минимальное количество выявляемого антигена вируса гепатита В) — 0,1 МЕ/мл (термостат); 0,05 МЕ/мл (термостатируемый шейкер); 0,01 МЕ/мл (термостат, 37 ± 1,0˚С, 18 часов)
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДС-ИФА-HBsAg-0,01
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА
Проведена оценка новой высокочувствительной тест-системы для выявления поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» (Приоритетная справка № 2006129019 от 10.08.2006). Оценку чувствительности теста проводили с использованием отраслевого стандартного образца ОСО-HBsAg 42-28-311-06П, образцов панелей «Boston Biomedica Inc.» (Вест Бриджуотер, Массачусетс, США) и «ZeptoMetrix Corp.» (Буффало, Нью-Йорк, США). Полученные данные показали, что «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» выявляет различные субтипы HBsAg с одинаковой эффективностью и на более раннем сроке сероконверсии относительно тестов сравнения. Наряду с высокой аналитической и диагностической чувствительностью система характеризуется высокой диагностической специфичностью.
Поверхностный антиген вируса гепатита В — НВsAg является основным маркером заболевания, регистрируемым задолго до появления клинических признаков болезни. Современные методы выявления HBsAg позволяют обнаруживать его в чрезвычайно низких концентрациях.
Согласно Приказу МЗ РФ № 322 от 2002 г. для тест-систем иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления HBsAg с 2003 г. регламентируется чувствительность не менее 0,1 МЕ/мл. Однако в отдельных случаях концентрация HBsAg в сыворотке или плазме крови может быть ниже предела чувствительности большинства используемых тест-систем, разрешенных к применению и имеющих диагностическую чувствительность 0,1 МЕ/мл:
— в инкубационном периоде, до начала клинических проявлений заболевания и перед исчезновением НВsAg из крови;
— в случае скрытой инфекции, так называемого оккультного гепатита, при котором не выявляются никакие маркеры вируса, но присутствует вирусная ДНК; другим вариантом скрытой инфекции может быть отсутствие детектируемых концентраций HBsAg при наличии антител к HBsAg [2,4];
— при формировании мутаций в вирусном геноме, вызывающих изменение структуры антигенных эпитопов НВsAg или биологических свойств вируса, например снижение секреции вируса из клеток [6]; при изменении антигенной структуры снижается «узнаваемость» НВsAg с помощью сертифицированных диагностических тестов, и следовательно требуется бóльшая его концентрация для детекции;
— при коинфекции вирусами гепатитов В и С или гепатита В и ВИЧ в результате подавления репликации вируса гепатита В другими вирусами [1, 3, 5].
Случаи возникновения посттрансфузионного гепатита В в результате использования «серонегативной» по HBsAg крови свидетельствуют о необходимости дальнейших работ по созданию и внедрению в практическое здравоохранение методов детекции антигена, обладающих высокой чувствительностью с сохранением высокой специфичности.
Цель настоящей работы – оценка иммуноферментной тест-системы, предназначенной для выявления или подтверждения поверхностного антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) и препаратах крови (альбумине, фибринолизине, иммуноглобулинах и лейкоцитарном интерфероне) с чувствительностью 0,01 МЕ/мл.
Таблица 1.
Оценка диагностической специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
на разных категориях населения
| Группа обследуемых | Количество исследуемых образцов | Количество ложнополо-жительных результатов | Специфичность
в данной группе, % |
| Здоровые доноры | 5348 | 11 | 99,8 |
| Больные с различными неинфекционными заболеваниями | 95 | 1 | 98,9 |
| Беременные женщины | 381 | 3 | 99,2 |
| Анти-HCV-позитивные | 972 | 3 | 97,7 |
| ВИЧ-инфицированные | 494 | 4 | 99,2 |
| Всего | 7290 | 22 | 99,7 |
Материалы и методы.
Характеристика теста. В основе нового теста лежит принцип амплификации или усиления сигнала за счет использования пары — биотинового и стрептавидинового конъюгатов. Действующим началом разработанной тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» являются моноклональные антитела мыши к HBsAg (анти-HBs; «HyTest», Финляндия), сорбированные на стрипах полистиролового планшета («Nunc», Дания). Исследуемый образец вносили в лунку по 0,1 мл. Без стадии отмывки последовательно вносили конъюгат-1, представляющий моноклональные антитела мыши к HBsAg, ковалентно связанные с биотином (ООО НПО «Диагностические системы», Н.Новгород), затем — конъюгат-2 — стрептавидин, меченный пероксидазой хрена («Sigma-Aldrich», Германия). Общая продолжительность реакции — 2 ч 25 мин (42°С).
При использовании шейкера (42°С) время проведения анализа сокращается до 1 ч 25 мин.
Стандартные образцы и панели. Аналитическую чувствительность нового теста оценивали с использованием Отраслевого стандартного образца ОСО-HBsAg 42-28-311-06П (ООО НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород, совместно с ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора), содержащего HВsAg в концентрации 20 МЕ/мл, откалиброванного по 2-му Международному стандартному образцу HBsAg — Second International Standard for HBsAg, subtype adw2, genotype A, NIBSC code number 00/588. Диагностическую чувствительность разработанной тест-системы анализировали с использованием образцов различных панелей: «Референс-панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), субтипы ay и ad» (ЗАО «Медицинский центр «Авиценна»), «Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg» (ЗАО «Вектор-Бест»), «Мастер-панель сывороток крови человека, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) субтипов ay и ad» (ГНЦ ВБ «Вектор»), «Контрольная панель мутантных вариантов HBsAg субтипов ayw1 и adw2» (ООО НПО «Диагностические системы»), панели производства «Boston Biomedica Inc.» (BBI), West Bridgewater, Массачусетс, США: HBsAg low titer performance panel PHA106; Hepatitis B surface antigen sensitivity panel PHA807 и PHA808, сероконверсионные панели Hepatitis B seroconversion panel subtype ad – PHM928, PHM932, PHM933, PHM934, PHM935A(M), PHM935B, PHM911 и сероконверсионные панели производства «ZeptoMetrix Corp.» (ZMC; Буффало, Нью-Йорк, США) – «Hepatitis B seroconversion panel» (Catalog No. HBV 6277, 6278, 6279) и «Acute to recovered disease Hepatitis B seroconversion panel» (Catalog No. HBV 6281). Исследования проводили в 2005-2006 гг. в лаборатории ООО НПО «Диагностические системы», в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора РФ и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (CDC; Атланта, США).
Для оценки диагностической специфичности разработанной тест-системы исследовали 7290 образцов сыворотки (плазмы) крови. Из них — 5348 образцов сыворотки (плазмы) крови здоровых доноров, любезно предоставленных сотрудниками ГУЗ Нижегородская областная станция переливания крови им. Н.Я.Климовой, 494 образца сыворотки крови ВИЧ-инфицированных лиц, 972 образца сыворотки крови анти-HCV-позитивных лиц,
381 образец сыворотки крови беременных женщин и 95 образцов от больных с различными неинфекционными заболеваниями (патология сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, онкологические заболевания).
В работе использовали также образцы некоторых мутантных вариантов рекомбинантного HBsAg (n=9) (ООО «НПО «Диагностические системы»).
Результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» составила 0,01МЕ/мл. Наряду с высокой чувствительностью, разработанная система характеризуется высокой специфичностью, которая в среднем составляет 99,7% с небольшими колебаниями в пределах исследуемых групп (табл.1).
Таблица.
Оценка диагностической специфичности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01»
на разных категориях населения
| Группа обследуемых | Количество исследуемых образцов | Количество ложнополо-жительных результатов | Специфичность
в данной группе, % |
| Здоровые доноры | 5348 | 11 | 99,8 |
| Больные с различными неинфекционными заболеваниями | 95 | 1 | 98,9 |
| Беременные женщины | 381 | 3 | 99,2 |
| Анти-HCV-позитивные | 972 | 3 | 97,7 |
| ВИЧ-инфицированные | 494 | 4 | 99,2 |
| Всего | 7290 | 22 | 99,7 |
Результаты тестирования образцов сывороток панели BBI «HBsAg low titer performance panel PHA106» с низким содержанием HBsAg (от 0,05 до 0,6 МЕ/мл) на разных тест-системах показали, что коэффициенты позитивности (отношение величины оптической плотности исследуемого образца к критической величине оптической плотности) образцов панели в «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» значительно превышали коэффициенты позитивности образцов в тестах сравнения. Система с повышенной чувствительностью эффективно выявляла HBsAg субтипов ad и ay во всех образцах панелей «Hepatitis B surface antigen sensitivity panel» BBI-807 и BBI-808 также с более высокими коэффициентами позитивности, чем в тесте сравнения.
Диагностическую чувствительность системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» анализировали на образцах 10 сероконверсионных панелей. Для сравнения использовали данные тестирования сероконверсионных образцов системами зарубежных производителей, представленные в инструкциях и паспортах к панелям. Подсчитывали общее количество реактивных образцов во всех панелях, выявленных каждым тестом. Систему, имеющую наибольшее количество позитивных по HBsAg образцов, признавали наиболее чувствительной. Кроме этого, определяли суммарное время (в сутках) с момента начального забора крови до 1-го позитивного образца с подсчетом средней величины.
Таблица 2
Результаты детекции HBsAg в сероконверсионных образцах 10 панелей.
| Наименование панели | Количество образцов, позитивныхпо HBV ДНК | Количество HBsAg-позитивных образцов | ||
| ДС-ИФА-HBsAg-0,01 | Abbott PRISM | Abbott AxSYM | ||
| BBI PHM 928 (n=7) | 7 (0) | 6 (2) | 5 (7) | 5 (7) |
| BBI PHM 932 (n=16) | 16 (0) | 12 (36) | 8 (50) | 7 (61) |
| BBI PHM 933 (n=6) | 6 (0) | 6 (0) | 5 (2) | 4 (7) |
| BBI PHM 934 (n=6) | 6 (0) | 6 (0) | 6 (0) | 5 (3) |
| BBI PHM 935A (M) (n=20) | 17 (9) | 17 (9) | 14 (21) | 13 (23) |
| BBI PHM 935B (n=12) | 6 | 11 | 10 | 9 |
| ZMC HBV 6277 (n=11) | 8 (26) | 9 (21) | 6 (33) | 4 (40) |
| ZMC HBV 6278 (n=11) | 11 (0) | 10 (4) | 8 (12) | 8 (12) |
| ZMC HBV 6279 (n=7) | 4 (19) | 5 (14) | 2 (26) | 1 (28) |
| ZMC HBV 6281 (n=12) | 10 (0) | 11 (0) | 6 (19) | 5 (22) |
| Общее количество образцов | 91 | 93 | 70 | 61 |
| Среднее время с момента начального забора крови до выявления 1-го позитивного образца, сут | 6,0 | 9,6 | 18,9 | 22,6 |
Примечание. В скобках – время (в сутках) с момента начального забора крови lо выявления 1-го позитивного образца; n – количество образцов в каждой панели.
Как следует из данных табл.2, тест-система «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» демонстрирует наилучшую чувствительность, выявляя 93 образца как HBsAg-позитивные из общего количества сероконверсионных образцов (n=108).
Один из альтернативных тестов детектировал HBsAg в 70 из 108 образцов, другой – лишь в 61. Вирусную ДНК детектировали в 91 образце. Время 1-ой детекции HBsAg с момента 1-го забора крови варьировалось от 0 до 50 дней (в среднем 18,9 дня) для 1-го теста сравнения и от 3 до 61 дня (в среднем 22,6 дня) – для 2-го теста. Для теста «ДС-ИФА-HBsAg-0,01» момент 1-й детекции HBsAg приходился на 0-36-е сутки (в среднем 9,6 дня). Время 1-й детекции вирусной ДНК варьировалось от 0 до 26 дней и в среднем составило 6 дней. Таким образом, обобщенные результаты тестирования сероконверсионных панелей демонстрируют, что использование теста с повышенной чувствительностью позволяет сократить HBsAg-негативный период и приблизить момент выявления ДНК на 9,3 дня по сравнению с 1-м альтернативным тестом и на 13 дней – по сравнению со 2-м тестом
Сравнительная реактивность мутантных вариантов рекомбинантного HBsAg
| Мутантный вариант рекомбинантного HBsAg | ДС-ИФА-HBsAg-0,01 | Тесты сравнения | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| rec HBsAg ayw1 G145R | 42,57,9 | 11,52,1 | 1,50,7 | 4,01,3 |
| rec HBsAg adw2 G145R | 17,04,4 | 6,11,7 | 1,10,6 | 3,71,5 |
| rec HBsAg adw2 Q129R | 5,25,4 | 3,51,8 | 0,70,6 | 0,80,8 |
| rec HBsAg adw2 Q129H | 34,18,6 | 10,22,4 | 1,10,6 | 2,61,2 |
| rec HBsAg adw2 Q129L | 6,55,4 | 3,31,7 | 0,90,7 | 0,90,8 |
| rec HBsAg adw2 T143K | 9,11,9 | 3,00,7 | 0,60,5 | 0,80,7 |
| rec HBsAg adw2 T 126N | 12,22,8 | 3,50,9 | 1,00,7 | 1,10,8 |
| rec HBsAg adw2 T 126S | 2,94,5 | 2,01,6 | 1,10,8 | 0,90,9 |
| rec HBsAg adw2 D144A | 8,24,0 | 2,41,1 | 0,60,5 | 0,90,8 |
| rec HBsAg adw2 M133H | 20,53,7 | 7,51,1 | 1,10,6 | 2,61,1 |
| rec HBsAg adw2 M133L | 40,59,0 | 132,0 | 1,40,7 | 3,71,3 |
| rec HBsAg adw2 K141E | 14,75,0 | 4,41,2 | 1,30,7 | 2,11,0 |
| rec HBsAg adw2 P142S | 29,56,3 | 5,31,5 | 1,40,8 | 2,21,2 |
Примечание. Данные представлены в виде коэффициента позитивности (отношение величины оптической плотности исследуемого образца к критической оптической плотности).
Как следует из данных табл.3, коэффициенты позитивности выявления мутантных вариантов HBsAg в разработанной системе превышают таковые в тестах сравнения.
Известно, что существует проблема выявления HBsAg при коинфицировании вирусом гепатита В и другими вирусами. Были проанализированы 473 образца сыворотки крови анти-ВИЧ-позитивных лиц. В 82 из ни обнаружен HBsAg. В 16 образцах сывороток крови от лиц с двойной инфекцией ВИЧ/вирусный гепатит В выявлен HBsAg в концентрации ниже 0,1 МЕ/мл. Причем 7 из них содержали антитела к HBcAg, а 9 не имели никаких других маркеров, кроме HBsAg, детектируемого в системе с высокой чувствительностью
Таким образом, полученные результаты демонстрируют высокую диагностическую значимость системы «ДС-ИФА-HBsAg-0,01». Использование высокочувствительного теста для выявления HBsAg позволяет сократить период диагностического (серологического) окна при вирусном гепатите В. Это положительно отразится на качестве диагностики гепатита, позволит снизить количество случаев скрытой инфекции, как с наличием дополнительного маркера анти-HBcore, так и при отсутствии любых маркеров, а также поможет скорригировать терапию при двойной инфекции. Высокая чувствительность тест-системы будет способствовать более эффективному выявлению мутантных форм HBsAg. Повышение чувствительности иммуноферментного теста для выявления HBsAg до уровня, сравнимого с чувствительностью молекулярно-генетических методов, позволяет рассматривать его в качестве возможной альтернативы другим методам, доступной и в рутинной лабораторной практике, которая повысит качество скрининга донорской крови и позволит снизить риск посттрансфузионного инфицирования вирусом гепатита В.
192 АНАЛИЗА
